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人外周血淋巴细胞的提取与保存
干细胞搜网 / 2014-05-19

干细胞搜网实验室人员教你如何分离外周血中的淋巴细胞,提取,培养并刺激T淋巴细胞生长,再用T淋巴细胞进行CAT质粒的转染,转染后测细胞的DNA修复能力(DRC)(HCR实验),具体的人外周血淋巴细胞的提取与保存如下

 

人外周血淋巴细胞的提取


一、采集血样,室温保存。

使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可;血量一般为2-5ml;一般地,1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞(PBMC,即淋巴细胞核单核细胞)。

 

人外周血淋巴细胞的提取与保存所用产品目录(点击了解)

 

二、提取淋巴细胞。

在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液,在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS(磷酸盐缓冲液),1:1混匀。然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中,注意要缓慢,使血样尽量位于提取液上层,不能太用力让血细胞扩散到下层,就没办法离心分层了。(这一步的操作应该尽量快速的完成,因为时间长了,红细胞就会在重力作用下沉降,混入到提取液中,对后面的离心造成影响)然后离心。1500rpm,15min,20摄氏度。

说明:

1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。实验过程中一直保持室温条件,一般20摄氏度比较适中,因为细胞的最适温度是体温37摄氏度,但是温度降低又可以降低细胞的代谢,两者有些矛盾,所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项:启封后应置4℃保存避免微生物的污染;分离液从冰箱取出后,不可立即使用,需待溶液温度升至室温时,摇匀后使用; 整个分离过程中,温度应控制在18-28℃且在无菌环境下,避免微生物的污染,否则会影响分离质量;未启封前在18-25℃避光保存,启封后置4℃保存,本品为真空包装,未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶,影响分离效果。(各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致)
淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异,借助离心产生的重力加速度,进行细胞的分离纯化的常用试剂,为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液,主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化,能除去红细胞和死细胞碎片,所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、PBS溶液是一种平衡盐溶液,还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液,但最常用的还是PBS溶液。
4、离心的条件有很多说法。转数范围为1500-2000rpm,时间范围为10-20分钟,温度为室温20摄氏度。推荐两步离心法:首先用1500rpm/min离心20min,如果白膜层足够一步就结束,如果发觉细胞不够,说明该病人的淋巴细胞比重较低,再重新用2000rpm/min离心10min

 

三、离心后,分四层。

淋巴细胞位于第二层(从上到下),呈白蒙蒙的一薄层。用5ml的小注射器吸取分离液层中的淋巴细胞,这里技巧性比较强,需要多次练习才能比较熟练的把淋巴细胞吸的比较完全。把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中。用小注射器前,需把针头拧紧,抽动几下,减小摩擦力。再次离心。1500r,10min,20摄氏度。
把离心后的上层液体倒掉,淋巴细胞位于离心管底的一小点白色的物质,一般会混有少量红细胞,尽量避免。加入4mlPBS缓冲液到离心管中,(并用加液枪吹打底部的白色物质,把其打散【该步也有认为不吹打的,以避免淋巴细胞粘在壁上,造成损失】)。注意换枪头。再洗涤两次,离心条件为:1500r,10min,20摄氏度。
说明:
1、有时离心后得到的淋巴细胞层很薄,淋巴细胞很少,这可能是离心转数不够,淋巴细胞还飘在分离中造成的,最好再用2000rpm,10min,20摄氏度再次离心一下。
2、吸取淋巴细胞的方法还可以用长嘴胶头滴管,不带刻度的,使用的时候在顶端套上一个橡皮吸头。这种方法比注射器使用方便,而且吸得更完全。
3、洗涤后离心的条件,离心范围为1500-2000rpm,通常用1500rpm就足够了,太高了容易把细胞离死。时间为10min,温度还是室温20摄氏度。
4、离心后,看到淋巴细胞中混有少量红细胞,在这个实验中问题不大。
5、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可,作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板,红细胞很难去掉。一般洗涤液用4-5ml即可。

 

四、用Trizol reagent 裂解淋巴细胞,提取RNA。

在离心管中加入1ml Trizol试剂,可以裂解除RNA以外的其他大分子物质,细胞膜,细胞器等。这个东西有致癌、致畸性,要带口罩,小心操作。用加液枪吹打离心管底部的淋巴细胞团块,把其打散。一般至少吹打30-60次,主要目的是把其打散,让Trizol试剂充分裂解淋巴细胞。把吹打之后的液体转移到EP管中,存放在-80摄氏度冰箱中。
说明:
1、TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
2、在TRIZOL中,RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当TRIZOL用量少于2-ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
3、最后用于装裂解细胞的EP管要塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

 

人外周血淋巴细胞的保存其实和绝大多数的原代细胞冻存一样,具体可以参考干细胞冻存及细胞复苏的使用方法及注意事项

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