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干细胞分离(cell isolation)纯化技术及基本原理
干细胞搜网 / 2014-07-14

讯 /干细胞搜Stemcell So/--细胞分离cell isolation,指的是将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程。而所谓细胞纯化更进一步强调从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化过程,使培养物成为单一类型培养物,甚至是遗传特性完全一致的培养物,后者即细胞系。分离和纯化两个概念之间没有截然的界限,许多情况下,细胞分离和纯化并不是完全彻底的,培养物中只能达到以某种细胞为主的程度,所以也成称为富集(enrichment)。 分离和纯化细胞的过程不仅仅在原代培养之前进行的,有时分离和纯化细胞的过程还贯穿于原代培养和继代培养的过程中,甚至是主要依赖培养过程实现分离和纯化细胞的目的。培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物中的比例如何,常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标。

  从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到分离纯化,主要是依据不同的细胞具有各种不同的特性来实现的,也可利用细胞的物理特性如密度,体积,电荷等,以及细胞生物学特性如特异的表面标志和功能。一种细胞,其数量稀少又难以识别往往就更不容易被分离纯化。因词虽然已经对造血干细胞的特性了解得比较清楚,但人们仍在努力探索更简单,更快捷的干细胞分离方法,因为通过常规方法富集到的干细胞远不能满足干细胞生物学和调控研究对干细胞数量和纯度的要求。将基于干细胞的物理特性和生物学特性的分离纯化方法相结合,通常可以获得较好的效果,也只有通过合理的综合应用两种以上不同的分离纯化方法,才可能在细胞回收率,细胞纯度及细胞活力等方面达到比较满意的效果。尤其是干细胞在组织中比例极低,也使人们不得不采用多步骤的分离方法,通常每一步骤都采用一种不同的分离参数。例如,在抗体介导的分离技术之前常西安用密度梯度法对目的细胞进行富集。

    最初的“预富集”步骤可以看作是减少体积的步骤,纸样可以减少随后分离步骤中世纪的用量。当采用多级分离步骤时,预先估计整个过程中的细胞损失是非常重要的,因为为了获得高纯度的细胞可能会影响到细胞的回收率。

 

细胞分离纯化的常用技术与基本原理

 

解离组织制备细胞悬液

  为了分离目的细胞首先必须将目的细胞所在的动物组织材料制备成单细胞悬液。细胞分散一方面是细胞分离纯化的前提;另一方面,在分散细胞的过程中,通过一定的辅助性方法,也能对组织细胞起到一定的分离纯化作用。

    机械分离以及酶学分离是组织分散成单细胞最常用的方法。在机械风力方法中,常用的技术包括用吸管或针头吹打,用组织研磨器或注射器研磨,用不锈钢或尼龙筛网搓洗等。其中按照组织内不同细胞的大小差异,亦一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞起到了对细胞的初步分离纯化目的。在酶学解离的方法中,常用的技术包括用胰蛋白酶消化,用螯合剂处理,永不涵钙镁离子的溶液浸泡等。用酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是不同组织细胞和间质的构成不同。例如,欲从皮肤材料中获取上皮细胞,就可利用皮肤的表皮和表皮结缔组织间的细胞间质构成不同的差异,就可先用胰蛋白酶消化这样就可以得到大量的上皮细胞。

 

 

密度梯度离心技术  

          

    利用细胞体积和密度进行分离纯化的技术均基于沉降作用。其基本原理是,在离心力的作用下,细胞在一定介质中的的沉降速率与细胞的体积及细胞密度和其周围介质的密度之差成正比。细胞的体积越大,其余分离介质的密度差越大,则细胞的沉降速率越快。对于特定的待分离细胞来说,其体积和密度是恒定的,可供选择的只是具有一定密度与黏度的分离介质。使之沉降的细胞密度应该比介质大,而使之漂浮的细胞密度应该比介质小。因此实施沉降技术分离细胞的关键在于选择密度梯度形成介质,故称将技术也称为密度梯度离心技术。

  逆流淘析分离技术是通过含细胞介质溶液的流力和福利与细胞所受离心力之间相互作用而分离细胞的一种技术。细胞置于一特殊的离心室中,离心室成锥形状,其定点指向沉降方向,细胞悬浮于以向心方向连续流动的介质溶液中,同时受到离心力的作用。当向外的离心力于内向的流立即浮力达到平衡时,每个细胞将按照它的的沉降速率达到其平衡位置。通过这一技术可进一步分离淋巴细胞和单核细胞。

 

选择性细胞凝集

    羟乙基淀粉和甲级纤维素可以使红细胞形成大的“钱串”,加速其沉降,从而比其他细胞更快地从造血细胞悬液中沉降出去。这一方法通常用于快速去除大量成熟红细胞,而不会对有核细胞群造成太大的损失。但是,与上面提到的密度梯度离心和逆流淘析步骤一样,这一方法并没有使干细胞群相对于有核细胞发生太多的富集。

 

基于不同粘附特性的细胞分离方法

    粘附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面,使某些类型细胞的基本生物学特性之一,但另一些细胞却缺乏这种能力;或某些细胞的粘附能力强,粘附作用快,而某些细胞的粘附能力弱或粘附作用慢。根据这些差异,可以分离或消除某些类型的细胞。这种将粘附较快的细胞与粘附较慢的细胞(货物粘附能力)的细胞分离开来并分别收集的处理过程就称为差粘附处理。差速粘附处理常用于分离细胞悬液中的成纤维细胞与其它组织细胞。

 

利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法

 

    单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。目前抗体介导的细胞分离技术主要有:抗体/补体介导细胞溶解法,流式细胞仪分选法,平面粘附分离法,免疫磁珠分离法等。从抗体介导技术获得细胞的家渡看,又可分为阳性细胞分选法和阴性细胞分选法。拟从混杂细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群,称为阳性细胞分选法;反之,拟除去表达与抗体相应膜抗原的细胞,而收集其余的细胞群体,称为阴性细胞分选法。其中上述抗体/补体介导细胞溶解法为阴性细胞分选法,其余3种方法既可以作为阳性细胞分选技术,也可以作为阴性细胞分选技术。

 

免疫溶解法

   当补体存在时,用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育,可以是具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理,将消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞须阿毕业或细胞培养物中,使抗体及补体作用于具有相应抗原的细胞并溶解之,而对该抗原阴性的细胞进行富集。细胞溶解法适用于细胞悬液或细胞培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。

 

流式细胞分选术

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术,综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术,对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。

流式细胞术是对单个微粒(如细胞、微生物和人工合成微球等)进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中,包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴,形成包含单个细胞的液滴,在激光束的照射下,这些细胞发出散射光和荧光,经探测器检测,转换为电信号(分别代表荧光、散射光、光吸收或细胞光阻抗),送入计算机处理,输出统计结果,并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群,分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液,所用仪器称为流式细胞计(flow cytometer)。

 

免疫磁珠分选技术

用免疫磁珠做细胞分选(MACS)是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。 原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合,或者已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上,实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。

 

  随着20世纪科技的不断发展,我们有望在不久的将来看到更加先进,更加便捷高效的干细胞分选技术,干细胞分选技术的发展与完善必将推动世界有关干细胞研究的加速前行。

 

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