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细胞复苏,接种,换液,培养,消化步骤及实验一览
干细胞搜网 / 2015-01-21
一、细胞复苏和接种
1. 37℃预热大鼠间充质干细胞培养液(RM-001)和基础培养液(RM-001B)。
2. 从液氮中取出细胞产品管,快速将其置入37℃水浴中解冻,直到管中只剩下最后一片结晶(注意:不要让水没过产品管)。
3. 在生物安全柜中,用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15 ml无菌离心管中,慢慢逐滴加入预温的37℃ 基础培养液(RM-001B)4-5ml混匀,边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液(RM-001B)冲洗产品管,并将其转移到15 ml离心管中,边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后,取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀,从中取10 μl计数。 这一步骤非常重要,能确定您收到的产品是否合格(详见如何计数复苏的细胞)
7. 细胞悬液在1 000 rpm,室温条件下,离心5分钟,去除上清。
8. 加完全培养液4-5ml, 调整细胞量,轻轻混匀细胞,备用。
9. 按5 000-7 500细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液(RM-001)3-5ml, 后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
 
二、细胞换液和培养
注意:复苏或传代后的细胞,请于24小时后,第一次更换培养液
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2 培养箱内培养24小时,此时细胞已完全贴壁,更换培养液后,请继续在37℃,5%CO2培养箱内培养。
2. 之后,每2-3天更换培养液1次,至细胞长至覆盖培养面的 80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前,请将培养液从4℃中取出,使其恢复到室温。
 
三、消化细胞
1.  消化液的配制:pH7.0-7.2 ,分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液,用前按1:1混合。将PBS或D-Hank'S液, 消化液,含10% FBS的基础培养液回复到室温。
2.  具体操作如下:
(1)吸去培养液,加入3 ml PBS或D-Hank'S液,使PBS或D-Hank'S液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后,吸去PBS或D-Hank'S液。
(2)每个T25培养瓶加入消化液 2 ml,使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
(3)25℃消化2分钟,在显微镜下看细胞回缩成圆形后,轻轻震动使绝大部细胞脱落。
(4)向每个培养瓶中加 3-5 ml 含10% FBS的 基础培养液(RA-001B) 中和胰酶的消化作用。
(5)用吸管轻轻吹打培养面使细胞完全脱落后,吸至15 ml无菌离心管内。
(6)20℃,1 500 rpm 离心 5分钟,弃上清。
(7)加入一定完全培养液(RM-001),调整细胞数量后,抽样加入胎盘蓝计数,得到细胞数和活性后,按细胞数传代或冻存。
 
四、细胞传代
1.  消化细胞(详见第三步)。
2.  按5000-7500个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。
3.  每个培养瓶中加完全培养液(RM-001)3-5ml,后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
 
五、细胞冻存
1.  调整细胞数5×105 /ml,加入一定量的基础培养液(RM-001B)。之后,配制等量的冷冻保护剂。
2.  冷冻保护剂的配制:FBS占80%,DMSO占20%
3.  将细胞悬液于冰浴中,慢慢逐滴加入冷冻保护剂,边滴加边摇动,加完后用轻轻吹打混匀。
4.  在冰浴中,将细胞分装于冻存管中,每管1ml或1.8 ml。
5.  将冻存管置于冻存盒(NALGENE Cat No. 5100-0001)内,放入-80℃冰箱中,24小时后转入液氮中保存。

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