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干细胞冻存及细胞复苏的使用方法及注意事项
干细胞搜网 / 2014-05-07

细胞冷冻保存使用方法

 

选择冻存处于对数生长数的细胞有助于提高复苏细胞存活率。

按照常用方法收集悬浮细胞或贴壁细胞于试管中。
按照培养细胞密度和所用细胞冻存管的尺寸计算所需冻存细胞数。
(参考:5×105 至 5×106 cells/ml)。
取相当于所需细胞数的细胞悬浮液量,置于离心管中,离心收集培养细胞(参考离心条件:1,000~2,000rpm,4℃,3至5分)。移去离心管中的上清液。
加入适量的WAK-Chemie二甲基亚砜高纯度细胞冻存液于离心管中,使细胞浓度为 5×105 至 5×106 cells/ml。缓慢地混合均匀,制成细胞混合液。
将离心管中的细胞混合液分装于已标示完全的冷冻保存管中。
直接将含细胞混合液的冻存管放入-80℃冰箱,长期冷冻保存。
若研究者需要液氮保存时,可将完全冻结的冻存管(放入-80℃冰箱后至少一昼夜)移至-196℃液氮罐。


冻存细胞复苏方法

 

从冰箱里取出细胞冷冻保存管,立即放入37℃ 振动水浴槽中快速解冻。
待冻存管中细胞混合液完全融化后,立即加入1ml细胞培养基于该冷冻管中与细胞混合,再将细胞混合液从冻存管中移入含有9ml该细胞培养基的试管中,混合均匀。
离心收集培养细胞((参考离心条件:1,000~2,000rpm,4℃,3至5分),移去上清液。
清洗细胞,充分洗净残留冻存液。
加入适量的新鲜细胞培养基,使用移液管缓缓地均匀细胞混合液。适量地稀释后,将细胞混合液移至事先准备好的培养瓶中。
镜检后,研究者可根据各自方法和需要来进行细胞培养。

注意:细胞复苏和冻存的关键之一就是使细胞快速度过0~-20度这个阶段,以减少冰晶的形成,但又不能过快,建议使用程序降温盒,没条件的话也可以使用棉花包裹后,4度40~60min,后直接-80,效果很好


WAK-Chemie二甲基亚砜高纯度细胞冻存液成分说明:
本品不含血清。含DMSO、葡萄糖等各种细胞营养成分、pH调节剂等成分。

 

储存方法
储存于4度以下。质量保障期从产品的生产日期起算,为期3年。3个月以上没有使用WAK-Chemie二甲基亚砜高纯度细胞冻存液的计划时,尽可能冷冻保存。为避免重复冻结-解冻过程可能导致的WAK-Chemie二甲基亚砜高纯度细胞冻存液品质下降和性能降低,推荐将 100mL 产品分装小瓶后,再存放于 4℃以下或-20℃冰箱冻存。


各种类型的细胞株冻存实验结果

 

 

细胞株 冻存期间 (年) 细胞存活率 (%)
(冻存温度 -80℃)
小鼠
Hybridome 5 90
Myeloma 5 90
L929 5 90
FM3A 5 90
BALB/3T3 5 90
大鼠
RLC-16 5 90
NKR 3 90
HAMSTER
CHO 3 90
V79 3 90
猴子
COS-1 3 90
Vero 5 90
EBV transformed cell 5 90
Fibroblast 5 90
Melanoma 5 90
SK-007 5 90
Jurkat 5 90
K562 5 90

 

 

 

 

 

 

实验室常见的细胞冻存和复苏参考问题汇总:

一.1、冻存液不要现配,因为DMSO现配可能会对细胞有毒性,
   2、解冻时,要尽快将冻存管整体升温至37度,因此有人将其直接置于38-40度的水浴中,
   3、复苏时,必须要离心去除DMSO,并用培养基洗涤1-2次。注意离心速度不要过快,1000rpm以下,我认为500-800为宜。

 

二.1.复苏当天不离心是可以的。离心对细胞的损害比DMSO本身对细胞的损害更大。24小时以后肯定要离心。
     冻存液配置好以后有就没有预冷?
   2.不要局限于冻存和复苏,多想想还有没有别的原因。培养基有没有问题?配置了多久?酸碱有没有变化?水质好不好?
   3.我曾经复苏过HL-60细胞,连着4、5次复苏失败,最后证实是培养基的问题。
     另外血清可以加到20%。


三.1、DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程,同时提高细胞内离子浓度,减少细胞内冰晶的形成,从而减少细胞损伤。
   2、复苏时还是离心去DMSO的好。


四.1.配冻存液时由于DMSO在溶解的过程中放出大量的热量,应将其先与培养液混匀后再加入血清,混匀后再加入细胞。
   2.对于比较难培养的细胞在复苏后应离心防止DMSO对细胞产生毒性作用,但是对于一些培养条件要求相对较低的肿瘤细胞可以不离心直接将细胞转入培养皿中培养,因为离心本身  对细胞的数量和质量会造成一定的损伤,不过这还要在实际工作中摸索。
   3.由于冻存管具有一定的厚度,在实际的复苏操作中可以将复苏用热水的温度调整到40-42度,这样可以缩短解冻的时间。
   4.在处理好要冻存的细胞后可以直接将细胞用厚棉花包好,放在泡沫盒中后放在-70度冰箱中过夜,次日再转入液氮罐中即可。
     这是我在日常的工作中的一点经验,楼主可以参考一下。

 

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