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干细胞调亡常见的检测方法
干细胞搜网 / 2014-05-07

干细胞凋亡的启动是干细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭,不同的外界因素启动凋亡的方式不同,所引起的信号转导也不相同,客观上说对干细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的,目前比较清楚的通路主要有:

 

1)干细胞凋亡的膜受体通路:各种外界因素是干细胞凋亡的启动剂,它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号,引起干细胞凋亡,我们以Fas -FasL为例:Fas是一种跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起干细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤:首先配体诱导受体三聚体化,然后在干细胞膜上形成凋亡诱导复合物,这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95,是由325个氨基酸组成的受体分子,Fas一旦和配体FasL结合,可通过Fas分子启动致死性信号转导,最终引起干细胞一系列特征性变化,使干细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子,可出现于多种干细胞表面,但FasL的表达却有其特点,通常只出现于活化的T干细胞和NK细胞,因而已被活化的杀伤性免疫细胞,往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域(DD,death domain)。三聚化的Fas和FasL结合后,使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇,吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白,它由两部分组成:C端(DD结构域)和N端(DED)部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合,该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分,由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8(caspase8)酶原发生同嗜性交联,聚合多个caspase8的分子,caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白,进而引起随后的级联反应,即Caspases,后者作为酶原而被激活,引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似

 

2)细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径
线粒体是细胞生命活动控制中心,它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心,而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1(Apaf-1)结合,使其形成多聚体,并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体,caspase-9被激活,被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等,从而诱导细胞凋亡。此外,线粒体还释放凋亡诱导因子,如AIF,参与激活caspase。可见,细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C释放和凋亡小体的形成。很显然,细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中,一类细胞(type1)中含有足够的胱解酶8 (caspase8)可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞(type2)如肝细胞中,Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大,而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。

 

一、形态学观察方法

(一)、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。

(二)、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

(三)、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。

(四)、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

 

二、DNA凝胶电泳

(一)、检测原理

细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。

(二)结果判断

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

 

三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。

(一)检测步骤

1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;

2、在微定量板上吸附组蛋白体’

3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘

4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’

5、加酶的底物,测光吸收制。

(二)用途

该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

 

四、检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法

1、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

2、结果判断:正常活细胞Annexin V 、PI均低染;凋亡细胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞Annexin V/PI均高染。

3、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此,Annexin V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

 

五、流式细胞仪定量分析

(一)检测原理

细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

(二)应用价值

流式细胞仪检测具有以下特点:

1、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确

2、可以做许多相关性分析

3、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期

 

六、DNA片断原位标记法

凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有二种:

1、原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·-OH端

2、原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。

 

七、检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。

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